本文标题："用冰冻碎裂法检视四膜虫的细胞膜-细胞显微镜"

发布者：yiyi ------ 分类: 站内动态 ------ 人浏览过 -----时间：2013-3-25 10:5:21

四膜虫的分泌物，很明显地是以一般向量性的合成方法进入质内网，而含有分泌物的大囊泡则由细胞内部移向细胞膜，所以在某些部位会存有一些不再移动的成熟长囊状泡，其内含物呈结晶形，此囊泡称为成熟的黏液泡（mature mucocyst）。

 
用冰冻碎裂法检视四膜虫的细胞膜时，我们在黏液泡上发现有由九个小颗粒，围着一个中央颗粒做环状排列。（直径15nm），此一构造我们称为融合蕊（fusion rosette），这与卡斯提罗及卡兹提出的假定部位相当。
 
草履虫丝泡分泌时，也可找到类似的部位，几个有关草履虫的实验，发现有些突变种缺少丝泡，或只在某些温度下，才释出丝泡。法国分子遗传学中心（center of molecular genetics）的贝生（Janine Beisson）、莱佛劝（Marcelle Lefort-Tran）和我，用冰冻碎裂法观察这些突变种，发现它们缺少融合蕊，或融合蕊很少。这是首次对分泌颗粒遗传基础的直接观察。我们推想融合蕊是融合的必须条件。
 
我们近的实验结果，也支持上面的推论，在实验室裏，我们采用奥斯丁（Austin）德州大学汤姆生（Guy A. Thompson）和他同事的方法，以待布卡因（Dibucanine，一种局部麻醉剂）来处理四膜虫，发现待布卡因会使所有成熟的黏液泡释出内容物，而所有的融合蕊也会消失不见，经几小时甦醒后，才又有成熟黏液泡及融合蕊的出现。
 
虽然许多原生动物都有融合蕊，但排列的方式却各不相同，这可能是分泌颗粒大小不同所致。在脊椎动物的细胞膜上较难找到类似的构造。少数脊椎动物和无脊椎动物有此类构造，但不知是否与融合蕊的功能相同。
 
发现四膜虫细胞膜上的融合蕊后，我们进一步探讨成熟黏液泡的膜与细胞膜上的配对位置（matching sites），冰冻碎裂图显示，粘液泡前端的环带（annulus）是由五、六排颗粒所组成，直径为10nm，但其顶端60nm直径大小地带，并无颗粒存在，这可能就是融合蕊的大小。细胞质中的黏液泡没有环带，故推想环带的形成与黏液泡的成熟有关。
 
融合膜上颗粒的配对排列，可称之为颗粒配对群（matching clusters of particles），这些配对群在二细胞间构成紧密接触的联结缝（gap junction），穿入相邻细胞膜的内部，使离子与微小水溶性分子互相流通，而渗透性的改变，在许多系统裏都与排空作用有关。
 
四膜虫黏液泡内的结晶形物质转变成无形质时，即开始融合，然后黏液泡变成长囊状，直径有700nm，一般认为这是因渗透性改变，水分流入、内容物溶解所造成的结果。随着物质的溶解，黏液泡扩胀，释出内含物，使膜破裂。但一般的电子显微镜照片并不能表示膜内的确实排列情形，而只表示分泌泡膜与细胞膜结合的后结果，此时分泌泡看起来像是Ω形，将照片倒过来，就像U形了。
 
由冰冻碎裂法看到细胞膜的P、E面，可知分泌泡从静止状况到Ω出现时，有关膜融合的一些细节，我们应记住成熟黏液泡的几何构造，是长型、有环带，且位于细胞膜融合蕊下方。二成对膜的融合，首先在融合蕊中央出现凹下的融合袋（fusion pocket），融合继续进行，融合蕊的大颗粒会在融合袋边缘分离开来，使融合袋增宽加深。
 
若在同一裂面上看到融合袋领襟内缘上有碎裂P面环带的颗粒，即表示二个半膜上P半边的融合已经完成。在E面也可看到同样结果，但因含有通往外界的孔洞，所以较为模糊不清。
 
成对的膜连合时，细胞膜与黏液泡膜上的裂面，有明显的球形囊泡及环带，融合袋破裂后其直径不超过250nm，所以环带很可能是用来增强环（ring）的构造，并防止因分泌所造成的细胞膜破裂，同时环带也是黏液泡湧回细胞内，成为部分细胞膜的支撑点。
 
因为冰冻碎裂法所拍的显微照片与生化性质相符，我们可据此拟出融合分泌程序的分子模型，来表示融合时进行的酵素作用，以及颗粒特殊排列的原因。因为只在融合蕊上60nm的光滑地区，及其他黏液泡膜环带内的光滑地区，才会发生融合，所以融合主要是涉及脂质的变化。伦敦大学的路西（Jack A. Lucy）认为融合常在脂质流动性增高的双重脂层中发生，而利用磷脂酸（phospholipase）移去脂质的排水端，即可增高流动性。四膜虫的颗粒环（rings of particles）可能就是受限于流动率的融合区。
 
我们对膜融合及囊泡分泌的起动机制了解得很少，其基本问题可能涉及细胞质内Ca++增多时，细胞就释出组织胺。待布卡因就是藉提高细胞质内Ca++的浓度，而造成四膜虫黏液泡的分泌。
 
对排空作用的研讨，还有一个更大的问题，就是融合后囊泡膜的去向。我们及其他的人都已获得证据，知道囊泡膜会在融合后成为细胞膜的一部分。因为在四膜虫的实验裏，并无囊泡移至细胞质的迹象，反而在融合部位发现了可能是黏液泡膜併入细胞膜的痕迹。国际卫生研究机构的郝哲尔（John E. Heuser）和李斯（Thomas S. Reese）发现，神经末稍的键泡若长期接受分泌的刺激，则神经细胞的细胞膜会因键泡膜大量的併入而显着地增厚膨胀。
 
这种合併的明显与否，视细胞种类而异。但在正常情况下，键泡膜并不会在融合点又发生合併现象，所以膜的增加并不明显。而且由吸收聚集的膜分子，并不一定在融合时即併入细胞膜，因此融合应视为是细胞膜的换新，只要不同时产生合併，膜融合似乎就是促进细胞膜生长、分化的增进机制。
 
如果将盐加入小鸭的饮水内，在短时间内，它们的分泌细胞的体积就已增加百倍。耶鲁大学药学系的巴内撤（Russell J. Barnnett）和他的同伴在高氏体内找到一种细胞膜（Na+－K+ ATPase），后来在小囊泡及新细胞膜上也找到过。他们认为这是因为含有酵素的囊泡，在细胞内扩大而将膜物质，送到细胞膜去。
 
精冠体分泌后也会促成膜的快速膨胀。但还没有人知道新精冠体的外膜，有多少是由精冠囊泡转变形成的，以及有多少是由分子库（molecular pools）裏重新聚集而成的。在其他许多具生长特性的例子裏（如植物花粉管的形成），囊泡融合对细胞膜的建造及酵素的组成，都很重要。
 
四膜虫是以二分法繁殖的单细胞生物，每个细胞週期中（大约四小时），它都必须为子细胞产生足够的新细胞膜，而且这些新细胞膜必须和原细胞膜一样（如在子午区重新形成的融合蕊等）。因为许多新细胞膜是由融合的黏液泡膜提供，因此我们认为细胞分裂后的每一融合蕊，都表示一个融合事件，这也可说明新细胞膜的局部增长现象，因为藉以产生局部增长的子午板（meridional template）在新细胞形成时仍保留着

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